바이러스학

바이러스학

바이러스 역가 : 바이러스 재료 중의 감염성 바이러스양을 측정한 감염과
in vitro에서는 CPE 관찰, 적혈구흡착현상을 통해 측정
시료 속의 바이러스 농도를 의미하며, 반응은 정량적( 플라크 분석, 형광 초점, 감염센터, 형질전환)이거나 감염의 유무로 판단하는 형식이다 

플라크 분석법 
배양세포 단층에 시료를 넣고 겔 형성 물질을 포함한 영양배지를 덮어 감염된 세포가 생산한 새로운 바이러스가 겔에 의해 바로 이웃한 세포만 감염시켜 원형의 감염된 세포군인 플라크를 형성하는 것을 분석하는 방법

- 플라크 분석법에 의한 바이러스 역가 산출법
1. 바이러스 원시로를 10배씩 연속 희석하여 각각의 희석시료에 0.1ml를 취하여 세포 단층에 감염시킨다
2. 적절한 시간 동안 배양시킨 후 세포 단층을 염색하고 플라크 수를 산정한다
3. 바이러스 역가 산출 시 오차를 최소화하기 위해 플라크 수가 10~100개 사이의 배양 용기의 플라크 수를 산정한다
4. 정확도를 높이기 위해 각 희석시료를 2~3번 반복실행 해 평균을 구한다
5. 만약 10의 –6승 희석 시료에서 17개의 플라크가 관찰되었다면 10의 –6승 희석 시료에는 17pfu/0.1ml 또는 170pfu/ml가 들어있고 바이러스 원시로의 역가는 170 x 10의 6승 또는 1.7 x 10의 8승/ml로 계산된다

- 박테리오파지의 플라크 에세이

1. 파지 희석액 (0.1ml) + 숙주 박테리아 액(1ml)을 37도에서 20분간 흡착 
2. soft agar medium(1ml) 첨가 후 37도에서 48시간 보육함
3. 플라크 수를 산정한다
- 동물 바이러스의 플라크 에세이
1. 숙주(adherent cell만 가능)를 단층으로 배양
2. 바이러스 희석액을 2ml/10cm 첨가
3. 37도 2시간 동안 흡착
4. soft nutrient agar(0.3%) 배지 10ml/10cm 첨가
5. 37도에서 5% CO2와 같이 넣고 보육
6. 24h~3주 뒤에 산정

동물 바이러스 플라크 에세이 유형
1. 세포변성효과(CPE) : 세포가 바이러스에 감염되어 사멸하여 세포배양 용기에서 떨어져 나가는 것으로 플레이트에서 관찰 시 맨눈으로 확인하기 위해 염색을 하는데, 이때 live cell은 neutral red로 염색하여 그 결과 플레이트 바탕은 red, plaque는 투명해지며 dead cell은 try pan blue로 염색하여 플레이트 바탕은 투명, plaque는 blue를 띤다
보통 죽은 세포는 터져서 염색이 불가능한데 염색이 가능한 세포들은 특이하게 죽었는데 세포가 터지지 않은 경우이다

2. hem adsorption(적혈구흡착 능력)
주로 enveloped virus에서 envelope의 spike가 세포에 접착하여 바이러스가 감염되어 단층으로 증식한다. 이후 보육을 실시하고 여기에 적혈구를 첨가하면 감염된 세포에 적혈구가 흡착한다. 이후 wash out을 통해 흡착 안 된 것은 씻어내고 붉은색으로 보이는 플라크 수를 산정한다. 예) 인플루엔자
3. 거핵세포 형성 바이러스 
감염된 세포가 감염 안 된 세포와 융합하여 핵이 여러 개인 큰 세포를 형성하는 바이러스
대표적 바이러스 : 헤르페스 바이러스

플라크 에세이 할 떄 주의할 점
정확도, 오차범위 : ± 2 / 루트 n(플라크 수) (%)

tumor virus의 titration : high density focus assay → tumor 형성

- normal cell
: contact inhibition으로 인해 monolayer만 형성, plate가 가득 차면 더 이상 자라지 않음 (동물세포는 맨눈으로 보면 투명해서 안보임)

- 반대로, tumor cell
: contact inhibition을 받지 않아 monolayer 위에 중첩되어 증식, tumor 바이러스에 감염된 부위는 밀도가 높아져 점이 형성

plant cell
: 나뭇잎에 연마제로 세포벽과 막에 상처를 내어 이를 통해 바이러스 용액을 넣어 감염하며 수용기가 없고 벡터 이용함 

end point dilution assay (종말점 희석 분석법)
: 바이러스의 독성, 저항성 측정 시 사용되며 방법은 단계적인 바이러스 희석액을 재료로 cell culture, animal, chick embryo를 감염시킨 후 변화를 관찰하고 보통 50% 감염하는 희석배수인 감염의 성립률로 표시
LD50 : 사망케 하는 희석배수, PD 50 : 마비시키는 희석배수

- physical 바이러스의 titration : 희석배율로 표시, HA assay
방법:바이러스 용액을 2배율씩 단계적으로 희석해 micro plate (96well)에 두 번씩 분주한다 이 후 0.5%의 적혈구를 첨가하고 30분 후 플라크 수를 산정한다
→ 장점 : 빠른 시간
   단점 : 측정하는 바이러스가 정해져 있음

HA, plaque assay 모두 안될 때 serology test 이용해 산정
serology test 방법 ≒ immune fluoresce ne assay
숙주에 감염시킴
숙주 상태에 따라 구분
ㄱ. live cell : antibody가 cell membrane 통과 못 함 → cell surface의 viral protein만 검출
ㄴ. fixed(아세톤이나 메탄올 처리해 탈수시켜 고정) cell : cell의 모든 부위에 있는 virus protein 검출
first antibody 투여
second antibody 투여
FITC 라벨과

C형 간염 진단 확진하는 방법 : Western 블록, PCR
확진할 수 있는 이유 : 똑같이 재조합된 core를 사용하여 숙주 protein이 섞일 수도 있지만 gel 전기영동을 하기 때문에
  예정된 자리에 밴드가 나오면 무조건 감염된 것이고 다른 자리에 나오면 밴드가 나오면 이물질이다

적혈구응집반응 억제 : 바이러스가 적혈구에 붙는 것을 방해하는 것
방법
항체를 희석하여 바이러스와 함께 배양하고 적혈구를 넣어준다
배양 후 적혈구응집반응을 억제할 수 있는 항체의 역가를 측정한다
적혈구응집반응을 억제할 수 있는 항체의 최대 희석 배율이 역가이다
- 이 시험법은 민감하고 간단하며, 비용이 적게 들고 신속히 수행할 수 있음